原創(chuàng) 生物世界 生物世界 收錄于合集#新型基因編輯工具 40 個(gè) #CRISPR＆基因編輯 129 個(gè)

　　如果你在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室呆過(guò)一段時(shí)間，那么你就會(huì)發(fā)現(xiàn)冰箱里總是裝滿(mǎn)了用于實(shí)驗(yàn)的限制性?xún)?nèi)切酶。這些酶可以識(shí)別特定的DNA序列（例如 BamHⅠ內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)為GGATCC）并將其切割，這也導(dǎo)致可能需要好幾種甚至幾十種限制性?xún)?nèi)切酶才能完成常規(guī)的分子克隆試驗(yàn)。

　　令人興奮的是，來(lái)自哈佛醫(yī)學(xué)院/麻省總醫(yī)院的 Benjamin Kleinstiver 研究團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)最新研究，有望徹底淘汰掉這些繁雜冗余的限制性?xún)?nèi)切酶。

　　因?yàn)镃RISPR-Cas核酸酶以可編程的方式裂解DNA，在體外分子應(yīng)用方面比限制性?xún)?nèi)切酶更有優(yōu)勢(shì)。

　　該研究開(kāi)發(fā)了一種無(wú) PAM 序列要求的 CRISPR-SpCas9 突變體——SpRY，可以在基因組上幾乎任何序列上切割 DNA，成為取代限制性?xún)?nèi)切酶的強(qiáng)力競(jìng)爭(zhēng)者，并將拓展 CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)在任意 DNA 序列上的應(yīng)用。

　　近年來(lái)，CRISPR 基因編輯技術(shù)發(fā)展迅猛，并顯著改變了基因編輯領(lǐng)域的格局，為科學(xué)家們自由操縱基因提供了前所未有的簡(jiǎn)便和高效的工具，但當(dāng)前的 CRISPR 技術(shù)并非完美無(wú)缺，仍存在一些局限性，并面臨許多挑戰(zhàn)。

　　例如，目前最常使用的基因編輯系統(tǒng) CRISPR-SpCas9，野生型 SpCas9 識(shí)別的基因組上的序列需要有一段短DNA序列——間隔序列前體臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。這也導(dǎo)致一個(gè)尷尬的情況，當(dāng)我們要編輯的基因組序列附近沒(méi)有可識(shí)別的 PAM 序列時(shí)，SpCas9 將無(wú)法識(shí)別我們要編輯的目標(biāo)基因組序列，也就無(wú)法執(zhí)行后續(xù)的基因編輯任務(wù)。

　　早在2020年，Benjamin Kleinstiver 團(tuán)隊(duì)就在 Science 期刊發(fā)表論文，嘗試構(gòu)建了首個(gè)幾乎可以識(shí)別整個(gè)基因組序列的 spCas9 突變體——SpRY，它不再需要特定的 PAM 序列才能編輯 DNA。他們發(fā)現(xiàn)，在人類(lèi)細(xì)胞中，SpRY 更喜歡含有 NRN PAM 的位點(diǎn)，而對(duì)含有 NYN PAM 位點(diǎn)的識(shí)別靶向能力較弱，（N=任意堿基，R=A或G，Y=C或T）。

　　從那時(shí)起，Benjamin Kleinstiver 團(tuán)隊(duì)意識(shí)到，除了在人類(lèi)細(xì)胞中編輯 DNA 外，SpRY 還可以做很多事情。在這項(xiàng)發(fā)表于 Nature Biotechnology 的最新研究中，研究團(tuán)隊(duì)探究了 SpRY 在分子克隆上的應(yīng)用，使得 DNA 操作更簡(jiǎn)單，不再受到序列的約束。

　　研究團(tuán)隊(duì)在體外測(cè)試了 SpRY 的 DNA 切割能力，通過(guò)使用超過(guò)130個(gè) gRNAs 對(duì)多種 PAM 進(jìn)行 SpRY DNA 降解（SpRYgests），他們驚訝地發(fā)現(xiàn)它基本上沒(méi)有 PAM 序列的要求，可以在幾乎任何序列上切割 DNA，包括野生型 SpCas9 的難切割位點(diǎn)。星空體育下載這一發(fā)現(xiàn)克服了在任意特定堿基上切割 DNA 的障礙。

　　Benjamin Kleinstiver 團(tuán)隊(duì)設(shè)想了一個(gè)精簡(jiǎn)的 SpRYgests 工具包：用戶(hù)可以根據(jù)自己的目標(biāo)序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的 gRNA，然后將其加入到反應(yīng)體系中，SpRY 就可以識(shí)別該序列，并在特定的位點(diǎn)上切割 DNA，從而可以自由操縱基因。

　　簡(jiǎn)而言之，在未來(lái)，我們可以將如今分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的限制性?xún)?nèi)切酶徹底淘汰掉，只需要一種SpRY即可完成所有的分子克隆實(shí)驗(yàn)。星空體育下載

　　不僅如此，SpRYgests 還將簡(jiǎn)化和加快更復(fù)雜的克隆方法，如構(gòu)建飽和突變庫(kù)。在當(dāng)前，讓公司合成這些庫(kù)可能非常昂貴——要花費(fèi)數(shù)千到數(shù)萬(wàn)美元，但 SpRYgests 可以在幾天內(nèi)生成這些庫(kù)，且只需幾十美元。

　　此外，除了分子克隆，SpRYgests 解鎖了在基因組中任意特定位置切割 DNA 的能力，這可以用于 DNA 文庫(kù)構(gòu)建、下一代測(cè)序等應(yīng)用上。

　　總的來(lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究展示了一種無(wú) PAM 序列要求的 SpCas9 突變體——SpRY，它可以在體外高效地切割任意 DNA 序列，在分子克隆領(lǐng)域展現(xiàn)出強(qiáng)大的應(yīng)用潛力，為科學(xué)研究帶來(lái)便利和效率！

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